🧪 FLUOstar / SPECTROstar Omega 🌊 Azul de Metileno (664 nm) ⚗️ CDNB Conjugación (340 nm) 🔬 Naranja de Metilo (464 nm)

Protocolo & Arquitectura de Ensayo: GHR y GST

Guía metrológica de pipeteo lógico (Zero Stress) para la discriminación entre Oxidorreducción (GHR recombinante), Conjugación Tiólica Clásica (GST Tau/Beta) y Biorremediación Activa vs. Adsorción Inerte con Limnospira platensis (syn. Arthrospira platensis) en microplacas de 96 pozos.

Distribución Metrológica de Microplaca (96 Pozos)

Columnas 1 a 10: Gradiente de enzima purificada o biomasa (Duplicados) · Columnas 11 y 12: Blancos Absolutos (0%).

          Volumen: 200 µL / pozo
        

11 [B1]

12 [B2]

A15.0µg

A25.0µg

A33.5µg

A43.5µg

A52.0µg

A62.0µg

A71.0µg

A81.0µg

A90.5µg

A100.5µg

A110.0µg

A120.0µg

B15.0µg

B25.0µg

B33.5µg

B43.5µg

B52.0µg

B62.0µg

B71.0µg

B81.0µg

B90.5µg

B100.5µg

B110.0µg

B120.0µg

C12.66µg

C22.66µg

C30.9mM

C40.9mM

C50.8mM

C60.8mM

C70.5mM

C80.5mM

C90.2mM

C100.2mM

C110.0µg

C120.0µg

D12.66µg

D22.66µg

D30.9mM

D40.9mM

D50.8mM

D60.8mM

D70.5mM

D80.5mM

D90.2mM

D100.2mM

D110.0µg

D120.0µg

E1100%

E2100%

E375%

E475%

E550%

E650%

E725%

E825%

E910%

E1010%

E110%

E120%

F1100%

F2100%

F375%

F475%

F550%

F650%

F725%

F825%

F910%

F1010%

F110%

F120%

G1100%V

G2100%V

G375%V

G475%V

G5100%M

G6100%M

G750%M

G850%M

G9Ext+N

G10Ext+N

G110%

G120%

H1H₂O

H2H₂O

H3Zarr

H4Zarr

H5Tris

H6Tris

H7GSH

H8GSH

H9NADPH

H10NADPH

H11Aire

H12Aire

💧 Orden de Pipeteo Lógico y Preparación

Estandarización bajo el protocolo "Zero Fricción Mental": pipetear en serie por reactivo común evita errores de volumen y reduce drásticamente el cambio de puntas.

Paso	Componente	Volumen Típico	Función	Recomendación Práctica
1º	Agua Milli-Q (c.b.p.)	120 – 140 µL	Ajuste a 200 µL	Pipetear primero en toda la placa con multicanal.
2º	Búfer de Ensayo (4X o 2X)	50.0 µL	Homeostasis pH 7.5 – 8.0	Tris-HCl 100 mM pH 8.0 (evita precipitación de reactivos).
3º	Cofactor Reductor (GSH)	10.0 µL	Donador tiólico (1.0 mM)	Stock 20 mM recién preparado en agua desgasificada.
4º	Sustrato / Colorante	5.0 – 10.0 µL	Aceptor (Azul / CDNB / Naranja)	CDNB en etanol 99.8%; Azul y Naranja en agua destilada.
🔄	MEZCLA PRE-INCUBACIÓN	—	Homogeneización	Agitación orbital suave en el Omega durante 5 segundos.
5º	Enzima / Células (DETONANTE)	5.0 – 20.0 µL	Inicio Catalítico	Añadir al final con multicanal inmediatamente antes de leer.

⚗️ Calculadora Instantánea de Stocks para Balanza Analítica

GSH Reducido (PM 307.32 g/mol)

              Para 10 mL de Stock 20 mM: 61.46 mg en H₂O.
            

Azul de Metileno (PM 373.90 g/mol)

              Para 25 mL de Stock 1.0 mM: 9.35 mg en H₂O.
            

CDNB Sustrato (PM 202.55 g/mol)

              Para 10 mL de Stock 20 mM: 40.51 mg en Etanol 99%.
            

Naranja de Metilo (PM 327.33 g/mol)

              Para 25 mL de Stock 2.0 mM: 16.37 mg en H₂O tibia.
            

⚗️ Estructuras Moleculares 2D y Visor Interactivo 3D (Antes vs. Después)

Visualización química de alta fidelidad: sustratos iniciales, estado cromóforo, mecanismo de biotransformación y productos finales tras la catálisis.

🧬 Antecedentes y Veredictos Científicos

Contraste mecanicista estricto según la literatura bioquímica y biofísica de las superfamilias de Glutatión Transferasas y Reductasas.

✅ SÍ FUNCIONA (Oxidorreducción)

Azul de Metileno λ = 664 nm

Colorante de fenotiazina tricíclico plano. Análogo estéreo-electrónico de plastoquinonas fotosintéticas.

In Vitro con GHR: La enzima transfiere 2 electrones del GSH hacia el anillo aromático, reduciéndolo a Leuco-Azul de Metileno (incoloro). Se lee una caída de absorbancia a 664 nm.

In Vivo (Espirulina): Las células vivas decoloran activamente vía enzimas redox + pool de NADPH. Las células hervidas solo adsorben el tinte pasivamente.

❌ NO CONJUGA (Incompatible GST pura)

Naranja de Metilo λ = 464 nm

Colorante azoico (-N=N-) con grupos donadores -N(CH₃)₂ y sulfonato. Carece de carbono electrofílico deficiente.

¿Por qué falla con GST?: Las GSTs puras no pueden atacarlo nucleofílicamente. No se genera ningún aducto conjugado medible.

¿Dónde SÍ se usa?: Solo en ensayos in vivo de biorremediación prolongada (24–72 h), donde las Azorreductasas celulares rompen el enlace azo.

⭐ ESTÁNDAR DE ORO (Conjugación)

CDNB Canónico λ = 340 nm

1-Cloro-2,4-dinitrobenceno. El sustrato de referencia mundial (Habig et al., 1974) para determinar actividad GST.

Mecanismo SNAr: La Ser16 de la GST desprotona el tiol del GSH a tiolato (GS⁻), que desplaza al cloro del CDNB.

Lectura en el Omega: Aumento progresivo lineal de absorbancia a 340 nm (\(\epsilon = 9.60\ \text{mM}^{-1}\text{cm}^{-1}\)).

📐 Ecuaciones Metrológicas y Cálculos en Microplaca

Ecuaciones estandarizadas para el paso óptico del menisco en pozos de 200 µL (\(\ell \approx 0.60\ \text{cm}\)) en el lector FLUOstar Omega.

// 1. CÁLCULO DE ACTIVIDAD REDUCTASA GHR (Azul de Metileno @ 664 nm) v₀ (DO/min) = |Pendiente inicial ΔA₆₆₄/min (0-60s)| - |Pendiente Blanco 0% (Cols 11-12)| Velocidad v₀ (µM/min) = ( v₀ / (ε₆₆₄ · ℓ) ) · 10³ Donde: ε₆₆₄ ≈ 74.0 mM⁻¹cm⁻¹ (0.074 µM⁻¹cm⁻¹) · ℓ ≈ 0.60 cm Actividad Específica (U/mg) = ( v₀ [µM/min] · 0.0002 L ) / ( mg Proteína en pozo ) // 2. CÁLCULO DE ACTIVIDAD GST CANÓNICA (CDNB @ 340 nm) v₀ (DO/min) = (ΔA₃₄₀/min Muestra) - (ΔA₃₄₀/min Blanco Espontáneo C11/H5) Velocidad v₀ (µM/min) = ( v₀ / (9.60 mM⁻¹cm⁻¹ · 0.60 cm) ) · 10³ Actividad Específica (U/mg) = [ v₀ / 5.76 ] · [ 0.200 mL / mg Proteína ] // 3. DESCRIMINACIÓN IN VIVO (Limnospira VIVA vs. MUERTA @ 664 nm) % Remoción Total (Cepa Viva) = [ (A₆₆₄_Blanco_t - A₆₆₄_Viva_t) / A₆₆₄_Blanco_0 ] · 100 % Bioadsorción Pasiva (Muerta) = [ (A₆₆₄_Blanco_t - A₆₆₄_Muerta_t) / A₆₆₄_Blanco_0 ] · 100 % Biotransformación Activa (GHR) = % Remoción Total (Viva) - % Bioadsorción Pasiva (Muerta)